作者：姜洋子 孙晶
该项研究及本科普工作获中华人民共和国科技部国家重点研发计划青年科学家项目(MOST, National Key R&D Program, 2019YFA0111900)支持
| 简介 |
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近期，本研究组在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上发表了研究论文：基于水凝胶的仿生“慢走”拉伸载荷维持人源半月板组织特异性祖细胞稳态。本项研究利用自制的基于水凝胶的拉伸载荷生物反应器，于体外模拟了“慢走”状态下半月板内细胞的力学微环境，测评了人源半月板祖细胞在三维培养条件下对力学的生物响应。 |
步行被世界卫生组织推荐为最佳运动养生的方式之一。日行多少步才算健康呢？据2017年Nature杂志报道，成年人每日的活动量约为6000-9000步[1]。对于健康人而言，每日步行数量越多对维护关节组织的健康越好。对于有关节慢性疾病和行动不便的长者来说，日均步行活动量降到了1200-2000步[2]。这么低的日常活动量是否足以维护关节组织的健康？本研究希望能提供相关证据。
提到关节健康，就不得不关注半月板组织。半月板是膝关节内的软骨垫，负责关节减震并吸收压力。半月板撕裂是临床上很常见的运动损伤，其中红区（有血管区）受损尚有自愈的可能，但白区（无血管区）受损则会导致关节的一系列反应，最终引发骨关节炎。可以说，保护半月板是维持关节健康的关键。
对于维护半月板健康，首要的研究对象就是负责维护组织的稳态及促进组织损伤修复的组织特异性干细胞。我们前期的研究证明了成人关节透明软骨组织内的干细胞、祖细胞能够维护软骨组织的稳态并进行组织修复再生[3]。半月板组织也不例外，段教授课题组在2007年就报道过半月板内有能扩增并且成软骨的细胞[4]，近期中山医的同事还利用单细胞测序鉴定出了一些半月板内源性的干细胞、祖细胞细胞亚群[5]。这类细胞具体是如何维护组织稳态，哪些因素能调控这类细胞进行组织修复再生，这些问题的解答能帮助我们加深对半月板组织修复机制的理解，并为未来利用这类细胞进行组织修复再生提供临床前基础。
作为重要的承重组织，半月板的生物力学在其发生、发育、发展过程中的作用无法忽略。在日常活动中，半月板组织受到的主要是重力带来的自上而下的压力以及活动带来的剪切力，但半月板内部的细胞所接受的力并不是压力和剪切力。这是由于半月板内部的胶原纤维束呈环向排列，当承载的压力被组织结构分散和吸收后，细胞最终受到的力以及形变多数其实是来源于沿着这些胶原纤维的环形牵拉力（图1）。对于半月板内牵拉力如何影响其内部细胞的研究具有很强的科学、技术和临床意义，然而目前相关研究较少。
图1. 半月板内部的力学传导示意图
软骨里的细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是重要的承重结构，而细胞周基质 (Pericelluar matrix，PCM) 和ECM有相似也有不同：在结构上它有着一些和ECM区不同的胶原和分子成分，在力学上它是载荷从ECM传导到细胞的缓冲区，并且这个区间直接受到来自细胞的信号调控。为了在体外最大程度的模拟半月板内细胞的受力情况，本次研究主要参考了Farshid Guilak研究组利用源自力学显微镜所观测的半月板细胞外基质ECM和细胞周基质PCM的弹性模量。其中，白区ECM为66千帕左右，而PCM的弹性模量要小得多，从27千帕到54千帕不等[6]（图2左）。鉴于GelMA水凝胶优越的生物相容性及力学可调节性，我们使用了GelMA水凝胶来构建与天然半月板内PCM类似的力学环境，并通过比对选用10%浓度、60%迭代度的参数（图2中）。我们从香港威尔斯亲王医院收集了9例关节置换的病人的半月板，利用单克隆形成、低密度种植的方法将其中的祖细胞进行分离、扩增、然后合并成3个批次，鉴定了成克隆能力和表面标记物。然后把这些细胞放进水凝胶里，再向水凝胶施加周期性的、10%的拉伸形变（图2右）。
图2. GelMA水凝胶模拟半月板受力的参数选择
为了能精确控制水凝胶内细胞的力学环境，我们设计并组装了一种基于磁力控制的三维细胞培养拉伸载荷生物反应器，可以精确的控制水凝胶的拉伸的力学强度，频率以及相关参数，克服了水凝胶很软，拉伸时两端难以固定，细胞受力不均等问题（图3左，专利已公开）。具体来说，就是把磁珠在成胶的过程中固定在水凝胶的一端，然后利用磁力来控制水凝胶的形变，磁场的有和无对应了水凝胶的拉伸和回弹。我们试了以10%的形变每天拉伸1小时、反复拉伸15天，GelMA水凝胶还能保持原型 （图3右）。
图3. 磁力控制三维细胞培养力学生物反应器的原理示意图
为了模拟长者日常缓步慢走时膝关节半月板的受力环境，我们选择以1步每秒的频次（0.5Hz/单膝受力），测试模拟每日散步一小时，即每天单个关节受力1800次的情景。我们将人源半月板祖细胞植入GelMA水凝胶中，将体外测试的力学参数设定为以10%形变，0.5Hz的频率每天拉伸1小时，反复拉伸15天 （图4）。在整个研究过程中，细胞-水凝胶构建体是培养在无血清、无特殊添加促软骨生长因子的培养基内，以此排除血清或生长因子对细胞活性的显著影响。
图4. 施加间歇性循环拉伸载荷后半月板祖细胞的活性和形态变化
在模拟”每日散步一小时”15天后，细胞活性仍大于94%，且细胞形态发生了明显变化，受力的细胞更圆更接近软骨形态，没有受力的细胞则长出了触角（图4）。最有意义的结果之一是，在没有软骨诱导因子的培养条件下，只要每日简单拉伸1800次，就显著的提高了半月板的干细胞、祖细胞分泌软骨细胞外基质的能力，包括了糖胺聚糖GAG，I型和II型胶原等（图5）。受力后的半月板祖细胞分泌更多II型胶原，说明这些细胞变得更像内侧半月板（白区）的细胞。
图5. 循环拉伸载荷促进细胞半月板特异性基质生成
这些细胞具体是如何对“慢走”的力学信号进行响应的呢？我们把拉伸15天后的细胞从水凝胶内消化取出进行RNA测序，筛选出了332个力学响应基因，分为了3个主要功能性群组，包括了力学敏感相关的基因群，细胞衰老相关的基因群，和调节细胞外基质的相关基因群（图6）。其中，整合素INT基因家族和部分具有软骨保护作用的基因群上调说明细胞分化和细胞基质的相互作用增强了，详细列表和功能分类可见文章原文。
图6. 循环拉伸载荷下hMeSPCs 中力学响应基因的筛选
我们再从干细胞生物学的角度进行观察：拉伸后的干细胞、祖细胞的系列干细胞的表面标记物发生了明显改变，包括CD90，CD73, CD105，说明了拉伸后的细胞进入分化程序（图7a）。而一些力学和细胞外基质相关的的受体同时也是干细胞标记物，包括了透明质酸的受体CD44，Fibronectin 的受体CD49e, CD29都有了显著的增加（图7a.b），说明细胞和胞外基质的相互作用增强了。拉伸后的细胞还表现出了更强的成克隆能力（图7c），一些干细胞自我更新的基因和通路也产生了变化，说明这些半月板干细胞/祖细胞在某种程度上被激活了。
图7. 循环拉伸载荷对半月板祖细胞的调控
除了对细胞的调控，载荷后水凝胶的结构也发生了显著变化。从图8左侧冰冻切片天狼星红染色可以看出，水凝胶受力后孔隙率增大，但是在10-15天之间，有细胞的受力组孔隙率不升反降（如图7右侧箭头所示），说明了有细胞的组产生了新的胶原, 填入了水凝胶降解所产生的空隙。
图8. 循环拉伸载荷促进水凝胶降解，也增强了细胞半月板祖细胞对周围基质的重塑
为研究受力后半月板祖细胞对周围环境的重塑，我们利用了荧光标记的水凝胶去解耦水凝胶的降解（图9）。如图8左所示，单拉力因素只造成很少的水凝胶降解，大规模降解主要发生于含细胞组，可能是由于细胞分泌的MMP等细胞外基质调节酶所致。施加力学刺激后含细胞组水凝胶降解得最多最快，但从组织学结果显示（图5，图8），从第10天开始，细胞-水凝胶的构建体的孔隙率降低，ECM显著增加。这再一次证明了细胞来源的ECM和水凝胶材料降解速率之间得到了迭代。以上结果是在体外获得，但是可以合理推测延伸，这种干细胞源的ECM逐渐迭代降解的生物材料的过程和策略也同样适用于体内损伤组织的修复和再生。
图9. 循环拉伸载荷下的细胞–水凝胶降解和ECM动态平衡
综上，本研究使用了 GelMA 水凝胶为人源半月板祖细胞提供三维仿生力学环境，在无血清/无TGFβ 的三维培养条件中模拟了半月板组织内细胞的生理载荷，发现“慢走”（0.5 Hz，1 小时/天）的力学载荷足以维持干细胞/祖细胞的表型，增加水凝胶中纤维软骨样 ECM 沉积和 ECM 重塑，并且鉴定出了332 个力学响应基因。
图10. “每日散步一小时“，维持人源半月板祖细胞稳态
本项体外研究结果表明，“每日散步一小时“的力学刺激频次即可激活半月板祖细胞维持组织稳态，如应用于体内或可维持半月板健康。
参考文献：
[1] T. Althoff, et al., Large-scale physical activity data reveal worldwide activity inequality, Nature 547 (7663) (2017) 336–339.
[2] C. Tudor-Locke, et al., How many steps/day are enough? For older adults and special populations, Int J Behav Nutr Phys Activ. 8 (2011) 80.
[3] Y. Jiang, et al., Human Cartilage-Derived Progenitor Cells From Committed Chondrocytes for Efficient Cartilage Repair and Regeneration, Stem Cells Transl Med. 5 (2016) 733–744.
[4] RL. Mauck, et al., Regional multilineage differentiation potential of meniscal fibrochondrocytes: implications for meniscus repair, Anat Rec (Hoboken). (2007) Jan;290(1):48-58.
[5] H. Sun, et al., Single-cell RNA-seq analysis identifes meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration, Ann Rheum Dis. 79 (3) (2020) 408–417.
[6] J. Sanchez-Adams, R.E. Wilusz, F. Guilak, Atomic force microscopy reveals regional variations in the micromechanical properties of the pericellular and extracellular matrices of the meniscus, J Orthop Res. 31 (8) (2013) 1218–1225.
原文信息
Jing Sun, Yau Tsz Chan, Ki Wai Kevin Ho, Li Zhang, Liming Bian, Rocky S. Tuan*, Yangzi Jiang*. “Slow walk” mimetic tensile loading maintains human meniscus tissue resident progenitor cells homeostasis in photocrosslinked gelatin hydrogel. Bioactive Materials, 25, (2023) 256-272. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.01.025
资助信息
该项研究获中华人民共和国科技部国家重点研发计划青年科学家项目(MOST, National Key R&D Program, 2019YFA0111900, YJ)、香港研究资助局优配研究基金(UGC, GRF,14104022, YJ)、香港中文大学博士后奖学金计划 (CUHK, IPDFS, JS)、香港创新科技委员会神经肌肉骨骼修复医学中心 (ITC, Health@innoHK, CNRM, YJ; RT)、以及香港中文大学利国伟利易海伦组织工程学及再生医学教授研究经费(CUHK, RT)的支持。
本文于2023年6月12日发表于微信公众号“BioactMater生物活性材料”，详情点击此处。
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