Category: 科普

作者：姜洋子 朱晓波 近期，本研究组在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上发表了研究论文，公布了一种针对早期骨关节炎的全新治疗策略，即每月关节腔内注射加载吡非尼酮(PFD)‑聚乳酸羟基乙酸(PLGA)微球的透明质酸注射液(图1)。该疗法在小鼠实验中效果显著，不仅能长效止痛，其针对软骨下骨、软骨、滑膜的全关节效用也令其有望成为新一代骨关节炎疾病改善疗法(DMOAD)。 图1. “每月一针关节腔内注射”：早期骨关节炎的新疗法 研究内容简介 由于骨关节炎(OA)发病机制复杂，靶点分散，目前临床上还没有获批的骨关节炎疾病改善疗法(Disease Modifying OA Drugs, DMOADs)，临床常用的疗法多数为对症治疗，即关节疼痛发作时用透明质酸(HA)润滑，用消炎止痛药镇痛，直到疾病发展至需要进行关节置换。因此，早发现、早干预才能更好的防治骨关节炎，提高步入老龄社会的人民生活质量。 通过对骨关节炎发病机制的研究，我们提出了针对软骨下骨作为早期OA干预靶点的治疗思路。在早期发病过程中，膝软骨下骨变化早于软骨退变(图2)，呈现骨丢失的表型(图2, D7‑28)，发展到了骨关节炎的末期软骨下骨则表现为增厚、硬化且矿化不良(图2，D56‑112)。研究报道成人膝骨关节炎的滑液中TGFβ1的平均浓度约为2‑5 ng/ml, 是正常关节的2‑5倍，而软骨下骨变化过程中释放的大量TGFβ1是导致后续骨关节炎进展的重要诱因之一。因此，控制关节腔内，尤其是软骨下骨的TGFβ1信号，是治疗早期骨关节炎的关键。 图2. OA发展过程中软骨下骨的病理特征 我们发现一种TGFβ1小分子抑制剂药物吡非尼酮(Pirfenidone, PFD)可纠正参与软骨下骨重塑的骨髓间质干细胞等细胞在骨关节炎环境中表现的矿化不良的病理特征，亦可抑制破骨细胞分化、成熟，有限缓解早期软骨下骨骨量丢失(图3)。吡非尼酮已被报道具有一定的抗炎、抗纤维化的作用，值得一提的是，口服药吡非尼酮已在临床上用于治疗特发性肺纤维化，其用药量约为每次 801 毫克，每日三次(即每日 2403 毫克)，时长不超过一年。因TGFβ是普遍表达的重要生物信号通路，长期高剂量口服吡非尼酮可能导致如恶心、光敏性和胃肠道等多种副作用。在此项应用中，为靶向早期 OA 关节中过量的 TGFβ，我们设计了一种关节腔内的缓释给药策略(图1)，有希望成为新一代更安全有效的 OA 治疗方法。 图3. PFD能纠正TGFβ1升高导致的成骨矿化不良，抑制破骨细胞分化成熟 我们采用了两种高分子生物材料缓释该小分子(图1，图4)，首先通过聚乳酸羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]将PFD包被形成微球，令PFD可在体内外稳定缓释；再用临床常用的透明质酸HA作为载药微球的载体，令载药微球能相对长期维持在关节腔内，从而在关节腔内长期保持PFD在其有效浓度范围。我们的数据表明，这种溶有 PFD-PLGA的透明质酸注射液在体内体外测试中表现出的缓释时长可达4周及以上，因此可实现每月单次关节腔内注射的给药频率。 图4. PFD‑PLGA微球形态，及其联合HA在体外及关节腔内的缓释特性 我们设计了关节腔内每月给药一次的干预频次，在小鼠中利用内侧半月板失稳诱导骨关节炎，在疾病早期开始给与治疗(图5A)，我们发现与生理盐水和目前临床上应用的高分子透明质酸相比，这种溶有 PFD‑PLGA的HA注射液可有效延缓了软骨下骨的结构性改变(图5)，并且维护关节软骨，抑制骨赘发生(图6)、且能缓解小鼠疼痛及所致的步态异常(图7)，还显著降低了滑膜内的炎症水平(图8)。 图5. 每月一次关节腔内注射PFD‑PLGA透明质酸注射液，有效防止小鼠软骨下骨产生骨丢失和骨硬化的OA相关病变，同时软骨下骨中TGFβ1的下游pSMAD2/3表达降低，对软骨下骨中TGFβ1有抑制作用，说明关节腔内给药成功，药效可达软骨下骨。 图6. 每月一次关节腔内注射PFD‑PLGA透明质酸注射液，12周后保护了关节软骨，降低骨赘生成。 图7. 每月一次关节腔内注射PFD‑PLGA透明质酸注射液，给药动物(橙色组)步态相对正常，滑膜和骨赘CGRP表达降低，说明该治疗能止痛 图8. 每月一次关节腔内注射PFD‑PLGA透明质酸注射液，给药动物(橙色组)滑膜评分显著降低，滑膜内M1巨噬细胞减少，说明该治疗能抗炎 因此，对于早期骨关节炎，这种“每月一针” 关节腔内缓释PFD的治疗方案在小鼠实验中疗效超出了预期：不仅对软骨下骨有“维稳”效应，还能止痛、抗炎、保护关节软骨、延缓骨关节炎发展，有望成为新一代DMOAD。 值得一提的是，本项新疗法所涉及的主要成分(PFD、PLGA、透明质酸)均已在临床应用多年，本研究提出的每月一次关节腔内局部给药的方案用药量小，给药频次低，安全性高，转化前景明朗。该疗法已申请专利群，项目组正在进行大型动物实验，希望能早日转化，造福广大骨关节炎患者。欢迎医药业界和投资方咨询洽谈合作。 原文信息      Xiaobo Zhu, Mingde Cao, Kejia Li, Yau-Tsz Chan, Hon-Fai Chan, Yi-Wah Mak, Hao Yao, Jing Sun, Michael Tim-Yun Ong, Kevin Ki-Wai Ho, Chien-Wei Lee, Oscar Kuang-Sheng Lee, Patrick Shu-Hang Yung, Yangzi Jiang*. Intra-articular sustained-release of pirfenidone as a disease-modifying treatment for early osteoarthritis. Bioactive Materials, Volume 39, 2024, Pages 255-272, ISSN 2452-199X. DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.05.028 资助信息 该项研究获中华人民共和国科技部国家重点研发计划青年科学家项目(National Key R&D Program, 2019YFA0111900，YJ)、国家自然科学基金委员会及研究资助局联合科研资助基金(NSFC/RGC, N_CUHK483/22，YJ),香港创新科技委员会神经肌肉骨骼修复医学中心(ITC, Health@innoHK, CNRM, YJ，HC，PY)、国家自然科学基金青年基金(NSFC 82302728, XZ)的支持。本研究获得了香港中文大学医学院威尔斯亲王医院容树恒教授、王添欣教授和何其威医生、香港中文大学生物医学学院陈汉辉教授的大力支持和帮助，在此表示衷心感谢。 本文于2024年09月18日发表于微信公众号“BioactMater生物活性材料”，详情点击此处。 欢迎转载，转载请注明出处，不得删改内容。

作者：姜洋子 孙晶 该项研究及本科普工作获中华人民共和国科技部国家重点研发计划青年科学家项目(MOST, National Key R&D Program, 2019YFA0111900)支持 简介 近期，本研究组在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上发表了研究论文：基于水凝胶的仿生“慢走”拉伸载荷维持人源半月板组织特异性祖细胞稳态。本项研究利用自制的基于水凝胶的拉伸载荷生物反应器，于体外模拟了“慢走”状态下半月板内细胞的力学微环境，测评了人源半月板祖细胞在三维培养条件下对力学的生物响应。 步行被世界卫生组织推荐为最佳运动养生的方式之一。日行多少步才算健康呢？据2017年Nature杂志报道，成年人每日的活动量约为6000-9000步[1]。对于健康人而言，每日步行数量越多对维护关节组织的健康越好。对于有关节慢性疾病和行动不便的长者来说，日均步行活动量降到了1200-2000步[2]。这么低的日常活动量是否足以维护关节组织的健康？本研究希望能提供相关证据。 提到关节健康，就不得不关注半月板组织。半月板是膝关节内的软骨垫，负责关节减震并吸收压力。半月板撕裂是临床上很常见的运动损伤，其中红区（有血管区）受损尚有自愈的可能，但白区（无血管区）受损则会导致关节的一系列反应，最终引发骨关节炎。可以说，保护半月板是维持关节健康的关键。 对于维护半月板健康，首要的研究对象就是负责维护组织的稳态及促进组织损伤修复的组织特异性干细胞。我们前期的研究证明了成人关节透明软骨组织内的干细胞、祖细胞能够维护软骨组织的稳态并进行组织修复再生[3]。半月板组织也不例外，段教授课题组在2007年就报道过半月板内有能扩增并且成软骨的细胞[4]，近期中山医的同事还利用单细胞测序鉴定出了一些半月板内源性的干细胞、祖细胞细胞亚群[5]。这类细胞具体是如何维护组织稳态，哪些因素能调控这类细胞进行组织修复再生，这些问题的解答能帮助我们加深对半月板组织修复机制的理解，并为未来利用这类细胞进行组织修复再生提供临床前基础。 作为重要的承重组织，半月板的生物力学在其发生、发育、发展过程中的作用无法忽略。在日常活动中，半月板组织受到的主要是重力带来的自上而下的压力以及活动带来的剪切力，但半月板内部的细胞所接受的力并不是压力和剪切力。这是由于半月板内部的胶原纤维束呈环向排列，当承载的压力被组织结构分散和吸收后，细胞最终受到的力以及形变多数其实是来源于沿着这些胶原纤维的环形牵拉力（图1）。对于半月板内牵拉力如何影响其内部细胞的研究具有很强的科学、技术和临床意义，然而目前相关研究较少。 图1. 半月板内部的力学传导示意图 软骨里的细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是重要的承重结构，而细胞周基质 (Pericelluar matrix，PCM) 和ECM有相似也有不同：在结构上它有着一些和ECM区不同的胶原和分子成分，在力学上它是载荷从ECM传导到细胞的缓冲区，并且这个区间直接受到来自细胞的信号调控。为了在体外最大程度的模拟半月板内细胞的受力情况，本次研究主要参考了Farshid Guilak研究组利用源自力学显微镜所观测的半月板细胞外基质ECM和细胞周基质PCM的弹性模量。其中，白区ECM为66千帕左右，而PCM的弹性模量要小得多，从27千帕到54千帕不等[6]（图2左）。鉴于GelMA水凝胶优越的生物相容性及力学可调节性，我们使用了GelMA水凝胶来构建与天然半月板内PCM类似的力学环境，并通过比对选用10%浓度、60%迭代度的参数（图2中）。我们从香港威尔斯亲王医院收集了9例关节置换的病人的半月板，利用单克隆形成、低密度种植的方法将其中的祖细胞进行分离、扩增、然后合并成3个批次，鉴定了成克隆能力和表面标记物。然后把这些细胞放进水凝胶里，再向水凝胶施加周期性的、10%的拉伸形变（图2右）。 图2. GelMA水凝胶模拟半月板受力的参数选择 为了能精确控制水凝胶内细胞的力学环境，我们设计并组装了一种基于磁力控制的三维细胞培养拉伸载荷生物反应器，可以精确的控制水凝胶的拉伸的力学强度，频率以及相关参数，克服了水凝胶很软，拉伸时两端难以固定，细胞受力不均等问题（图3左，专利已公开）。具体来说，就是把磁珠在成胶的过程中固定在水凝胶的一端，然后利用磁力来控制水凝胶的形变，磁场的有和无对应了水凝胶的拉伸和回弹。我们试了以10%的形变每天拉伸1小时、反复拉伸15天，GelMA水凝胶还能保持原型 （图3右）。 图3. 磁力控制三维细胞培养力学生物反应器的原理示意图 为了模拟长者日常缓步慢走时膝关节半月板的受力环境，我们选择以1步每秒的频次（0.5Hz/单膝受力），测试模拟每日散步一小时，即每天单个关节受力1800次的情景。我们将人源半月板祖细胞植入GelMA水凝胶中，将体外测试的力学参数设定为以10%形变，0.5Hz的频率每天拉伸1小时，反复拉伸15天 （图4）。在整个研究过程中，细胞-水凝胶构建体是培养在无血清、无特殊添加促软骨生长因子的培养基内，以此排除血清或生长因子对细胞活性的显著影响。 图4. 施加间歇性循环拉伸载荷后半月板祖细胞的活性和形态变化 在模拟”每日散步一小时”15天后，细胞活性仍大于94%，且细胞形态发生了明显变化，受力的细胞更圆更接近软骨形态，没有受力的细胞则长出了触角（图4）。最有意义的结果之一是，在没有软骨诱导因子的培养条件下，只要每日简单拉伸1800次，就显著的提高了半月板的干细胞、祖细胞分泌软骨细胞外基质的能力，包括了糖胺聚糖GAG，I型和II型胶原等（图5）。受力后的半月板祖细胞分泌更多II型胶原，说明这些细胞变得更像内侧半月板（白区）的细胞。 图5. 循环拉伸载荷促进细胞半月板特异性基质生成 这些细胞具体是如何对“慢走”的力学信号进行响应的呢？我们把拉伸15天后的细胞从水凝胶内消化取出进行RNA测序，筛选出了332个力学响应基因，分为了3个主要功能性群组，包括了力学敏感相关的基因群，细胞衰老相关的基因群，和调节细胞外基质的相关基因群（图6）。其中，整合素INT基因家族和部分具有软骨保护作用的基因群上调说明细胞分化和细胞基质的相互作用增强了，详细列表和功能分类可见文章原文。 图6. 循环拉伸载荷下hMeSPCs 中力学响应基因的筛选       我们再从干细胞生物学的角度进行观察：拉伸后的干细胞、祖细胞的系列干细胞的表面标记物发生了明显改变，包括CD90，CD73, CD105，说明了拉伸后的细胞进入分化程序（图7a）。而一些力学和细胞外基质相关的的受体同时也是干细胞标记物，包括了透明质酸的受体CD44，Fibronectin 的受体CD49e, CD29都有了显著的增加（图7a.b），说明细胞和胞外基质的相互作用增强了。拉伸后的细胞还表现出了更强的成克隆能力（图7c），一些干细胞自我更新的基因和通路也产生了变化，说明这些半月板干细胞/祖细胞在某种程度上被激活了。 图7. 循环拉伸载荷对半月板祖细胞的调控 除了对细胞的调控，载荷后水凝胶的结构也发生了显著变化。从图8左侧冰冻切片天狼星红染色可以看出，水凝胶受力后孔隙率增大，但是在10-15天之间，有细胞的受力组孔隙率不升反降（如图7右侧箭头所示），说明了有细胞的组产生了新的胶原, 填入了水凝胶降解所产生的空隙。 图8. 循环拉伸载荷促进水凝胶降解，也增强了细胞半月板祖细胞对周围基质的重塑 为研究受力后半月板祖细胞对周围环境的重塑，我们利用了荧光标记的水凝胶去解耦水凝胶的降解（图9）。如图8左所示，单拉力因素只造成很少的水凝胶降解，大规模降解主要发生于含细胞组，可能是由于细胞分泌的MMP等细胞外基质调节酶所致。施加力学刺激后含细胞组水凝胶降解得最多最快，但从组织学结果显示（图5，图8），从第10天开始，细胞-水凝胶的构建体的孔隙率降低，ECM显著增加。这再一次证明了细胞来源的ECM和水凝胶材料降解速率之间得到了迭代。以上结果是在体外获得，但是可以合理推测延伸，这种干细胞源的ECM逐渐迭代降解的生物材料的过程和策略也同样适用于体内损伤组织的修复和再生。 图9. 循环拉伸载荷下的细胞–水凝胶降解和ECM动态平衡 综上，本研究使用了 GelMA 水凝胶为人源半月板祖细胞提供三维仿生力学环境，在无血清/无TGFβ 的三维培养条件中模拟了半月板组织内细胞的生理载荷，发现“慢走”（0.5 Hz，1 小时/天）的力学载荷足以维持干细胞/祖细胞的表型，增加水凝胶中纤维软骨样 ECM 沉积和 ECM 重塑，并且鉴定出了332 个力学响应基因。 图10. “每日散步一小时“，维持人源半月板祖细胞稳态 本项体外研究结果表明，“每日散步一小时“的力学刺激频次即可激活半月板祖细胞维持组织稳态，如应用于体内或可维持半月板健康。 参考文献 [1] T. Althoff, et al., Large-scale physical activity data reveal worldwide activity inequality, Nature 547 (7663) (2017) 336–339. [2] C. Tudor-Locke, et al., How many steps/day are enough? For older adults and special populations, Int J Behav Nutr Phys Activ. 8 (2011) 80. [3] Y. Jiang, et al., Human Cartilage-Derived Progenitor Cells From Committed Chondrocytes for Efficient Cartilage Repair and Regeneration, Stem Cells Transl Med. 5 (2016) 733–744. [4] RL. Mauck, et al., Regional multilineage differentiation potential of meniscal fibrochondrocytes: implications for meniscus repair, Anat Rec (Hoboken). (2007) Jan;290(1):48-58. [5] H. Sun, et al., Single-cell RNA-seq analysis identifes meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration, Ann Rheum Dis. 79 (3) (2020) 408–417. [6] J. Sanchez-Adams, R.E. Wilusz, F. Guilak, Atomic force microscopy reveals regional variations in the……

作者：姜洋子 李宇晟 本科普工作获国家重点研发计划干细胞与转化医学重点专项2019YFA0111900项目支持（姜洋子 香港中文大学 李宇晟 湘雅医院）         坊间常提及干细胞治疗，都说它能令人永葆青春、返老还童，这是真的吗？ 1.干细胞不是万能的         干细胞作为再生医学和细胞治疗的重要分支和发展方向，确实有治疗多种疾病的潜力。比如，干细胞作为种子细胞可以参与受损组织的修复再生；干细胞可以分泌很多细胞因子和生长因子，改善损伤组织的微环境；干细胞还具有免疫调节能力，能控制炎症反应，有利于损伤组织的修复等等。但是干细胞不是万灵药，想用干细胞治病，还要用得安全又有效，在细胞选择、给药方案以及治疗机理上有一系列复杂又精密的要求。 2.没有干细胞是万万不能的         人体的组织细胞各司其职，比如：皮肤细胞负责保护身体，肌肉细胞可以主导收缩运动，干细胞却没有这类特定的职责。可干细胞却有一种特殊能力，即它能变成人体中的任何一种细胞。举个例子，最著名的万能干细胞就是受精卵细胞。受精卵是人类第一颗干细胞，也是第一代干细胞。胚胎就是原始的干细胞，随着胚胎的生长发育，干细胞分化为人体的各种组织器官。 因此，对我们每个人来说，没有干细胞是万万不能的。         研究干细胞如何参与各种组织的发生和发展是很有意义的，当我们想用这些细胞治疗疾病的时候，就可以借鉴这些组织发育的过程，让干细胞遵循类似的步骤去修复受损的组织，延缓和控制病情，参与系统性的调节甚至痊愈。 ▲干细胞与干细胞也大不一样 3.干细胞治疗膝骨关节炎的现状         临床常见的关节软骨损伤是运动创伤，多发于年轻人，而软骨退变多发于老年人。关节的软骨组织不能自动修复，损伤的软骨若不及时治疗，将蔓延影响周围的正常软骨，再加上不断受力和磨损，最后演变成骨关节炎。         （1）修复早期轻度软骨损伤，为缺损打上补丁。举个例子，写进教科书的自体软骨细胞移植（ACI），就是经典的能令缺损处软骨再生的办法：取两颗红豆大小的健康软骨组织，就能在实验室收获几百万个软骨细胞，再用这些细胞作为种子细胞填补缺损组织。这种方法能从源头解决病因，预防严重骨关节炎的发生。 ▲临床已开始应用的自体软骨细胞移植（ACI）方法         除了自体软骨细胞，组织特异性的成体干细胞也可以用于软骨组织再生。近年来能作为软骨再生种子细胞的干细胞包括软骨干细胞/祖细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜来源干细胞、脂肪来源干细胞等等。         （2）对于中重度骨关节炎，整个关节都受到了影响，关节疼痛，压痛，僵硬，肿胀，活动受限，这时候可不是打上补丁就万事大吉了。那么，干细胞能治疗这类中晚期的骨关节炎吗？对此科学家们正在进行紧锣密鼓的研究。中重度骨关节炎受累的关节组织中晚期骨关节炎的关节里炎性蔓延，受累的组织有很多，又相互作用。目前认为首先要解决的是损伤、形变、炎症和慢性疼痛。干细胞能分泌细胞因子和生长因子，改善损伤组织的微环境；干细胞还具有免疫调节的能力，可以控制炎症反应，那么它们在中晚期的骨关节炎治疗中有用吗？有啥用？咱们来一起看看目前关于干细胞治疗膝骨关节炎的临床研究结果怎么说。        有报道的临床病例多是采用间充质干细胞，主要为骨髓来源的间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞，因为这些细胞相对容易取得。比如用患者自体脂肪组织来源的间充质干细胞，通过超声引导的方式进行关节腔穿刺递送，研究结果显示患者疼痛程度和关节功能得到明显改善，没有出现严重的副作用，疗效观察时间为6个月到1年不等。还有采用自体骨髓来源的间充质干细胞治疗膝骨性关节炎的报道，通过向关节腔注射间充质干细胞或向软骨下骨的骨髓损伤区域注射间充质干细胞，改善了骨关节炎患者的疼痛和关节功能，疗效观察时间为8-16年。值得一提的是，最新发表的一项临床研究称，向骨关节炎患者的软骨下骨缺损区注射间充质干细胞能推迟部分患者接受关节置换的时间，改善了患者关节软骨的损伤。由于干细胞的很多功能还有待研究，干细胞治疗的临床应用还需要进一步完善，科学家正在积极探寻使用干细胞安全有效的修复炎性受损关节的方法。我们将一些有代表性的临床试验结果概括总结于下表，以飨读者。 病程 细胞、干细胞的种类 技术成熟度 研究结果 疗效持续时间 （随访时间） 参考文献     早期 骨软骨缺损 自体软骨细胞 （ACI） 临床应用 可再生受损软骨，此方法已经写入教科书，是常规方法。研究者在术后10-20年间随机访问了224名患者，获得92%满意效果，74% 认为10-20年后的治疗效果保持得很好。 10-20年 1 基质介导自体软骨细胞 （MACI） 临床应用 效果同上，研究收到34名患者回复，其中11位受访者中的8位认为他们的膝盖和从前一样好。 1-8年 2   软骨前体细胞、软骨祖细胞、软骨干细胞（CDPC, CSPC, CDSC） 临床应用 用于15名大面积骨软骨缺损病人的组织修复再生，其中13人新生成的软骨和原软骨相似，14个人的软骨下骨光滑且有规则。实验结果显示缺损再生，疼痛缓解，临床效果稳定。 随访1年 3       中期 滑膜来源间充质干细胞 （SDSC） 临床试验 试验包含五名有膝关节病变的患者，结果显示疼痛，症状和日常活动在术后两年有明显改善，无不良症状。 2 年 4   脂肪来源间充质干细胞 （ADSC，ASC） 概念性临床试验 试验招募了53名（18-70岁）患者，4级以下损伤，70%以上的病人有明显改善。 6-12个月 5     晚期 骨关节炎 骨髓间充质干细胞 （BMSC） 随机性临床试验 30名病人，结果显示有效缓解了软骨和软骨下骨的病症。 8-16年 6 滑膜来源间充质干细胞 （SDSC） 临床试验 试验包含10名患者，结果表明治疗初步有效，这种细胞移植相对于其他方法对患者有较小的影响，但还要做更多的研究。 大于3年 7   骨髓间充质干细胞 软骨下骨注射 （BMSC） 临床试验 试验招募了140名患者（平均75.4岁），每个人的两侧膝盖均有疼痛，每名患者一侧做了膝关节置换，另一侧在软骨下骨注射了细胞，结果表明部分接收细胞治疗的关节可以推迟关节置换的时间，每年膝关节置换术发生率为1.19%。 5-15年   8   参考文献： 1. Peterson L, Vasiliadis HS, Brittberg M, Lindahl A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am J Sports Med. 2010 Jun;38(6):1117-24. 2. Behrens P, Bitter T, Kurz B, Russlies M. Matrix-associated autologous chondrocyte transplantation/implantation (MACT/MACI)–5-year follow-up. Knee. 2006 Jun;13(3):194-202. 3. Jiang Y, Cai Y, Zhang W, Yin Z, Hu C, Tong T, Lu P, Zhang S, Neculai D, Tuan RS, Ouyang HW. Human Cartilage-Derived Progenitor Cells From……

作者：姜洋子，朱晓波，孙晶，曹明德 香港中文大学 (yangzjiang21@cuhk.edu.hk) 本科普工作获国家重点研发计划干细胞与转化医学重点专项2019YFA0111900项目支持（姜洋子 香港中文大学） 引言 NBA的传奇球星韦德在2013年接受采访时说，“我非常后悔十一年前切除了半月板，它导致了我日后连绵不断的膝盖伤病”。在刚刚结束的第十四届全运会上，中国香港的击剑奥运冠军张家朗也是因为半月板的问题直接退赛。小小一块半月板受到损伤，竟成为了这么多运动员的梦魇。 今天我们就和大家分享一些有关半月板的小知识以及和半月板修复与再生相关的最新研究进展。 图片来源于ESPN 图片来源于雅虎新闻 什么是半月板 可能很多人不知道半月板是什么，也不知道半月板在哪里。 半月板是膝盖里面的缓冲垫，位于膝关节股骨（大腿骨）和胫骨（小腿骨）之间，每个膝关节都有一对这样的缓冲垫，其形态酷似新月，所以叫半月板。 这一对半月板分别位于膝关节的内外两侧，内侧半月板较为宽大，呈“C”字形，覆盖了关节内侧约60%的关节软骨，外侧半月板相对较小，呈“O”字形，覆盖了关节外侧60-80%的关节软骨1。 图片来源于互联网；https://kneeworld.in/meniscal-tear 半月板不仅是膝关节内减震的缓冲“垫片”，同时它也是关节内的重要软骨组织，和关节面的软骨一样可以产生滑液润滑关节，负责保持关节的灵活和稳定。 半月板损伤是怎么回事 半月板在结构和功能上支持着膝关节的正常活动，同时也极易受到损伤，引发损伤的原因主要有以下两类： 1. 创伤性损伤：常见于年轻人，高发于运动损伤。在运动过程中的急速变向、反复弹跳和撞击等动作都容易造成半月板软骨所承受的瞬时压力增高，当压力超出了可承受范围，半月板就会撕裂。 2. 退变性损伤：多见于老年人。随着年龄增长，半月板也会发生老化，又称退行性病变。具体表现为半月板的弹性和耐磨性能逐渐下降，无法再像年轻时那样承受膝关节的反复活动摩擦。即便不是剧烈的活动，也可能引发半月板的撕裂。这也是很多中老年患者虽然没有明确的外伤史，也会出现半月板损伤的原因。 半月板受伤了怎么办，多休息能好吗 一般的人体组织受到损伤后，在损伤区域有良好的血液供应是组织愈合的关键，但是对受损的半月板而言，血供能促成的组织愈合程度和质量却是医学科学家们一直在探讨的一件事。为什么会这样呢？这是因为半月板的结构太特殊了，它的主体是由坚韧的细胞外基质例如胶原纤维（占组织干重的75%）构成，其中的细胞只占很少的部分，正常的半月板不是完全依赖血液供应来获取氧气和营养的。 半月板是一个血管分布较少的软骨组织，只有10~30%与关节囊相连的部分区域有血液供应1，这些区域肉眼看上去是红色的，所以被称为“红区”（内侧半月板边缘约有10~30%，外侧半月板边缘约有10~25%）。其余更靠近关节中心的半月板在结构上越来越像关节面的透明软骨，这些部位没有血管长入，是由关节内滑液的渗透来供给营养，被称为半月板的“白区”。 图片由本团队用BioRender绘制；右上图：人半月板白区缺损的离体模型，图中正在使用紫外光固化的水凝胶配合传统缝线尝试修复（Credit：Jiang Lab & Research Group） 医生在设计半月板损伤治疗方案时，首先会查看损伤的部位。如果损伤仅仅在红区是相对好办的。半月板在红区受到的损伤因为有血运，在制动（石膏或支具固定）或缝合后，是有自愈可能的。但是在白区或半月板的前后角受到的损伤，就和关节面的软骨受伤情况类似了，很难只靠休息就完全恢复。 老话常说“伤筋动骨一百天”，但半月板损伤却不是一个时间能解决的问题。当关节里的减震垫半月板受到损伤之后，和它直接接触的关节面软骨的局部受力也会因此而改变，一些区域受到的压力将大大提高2（见下图，红色代表了高应力区域），这样后续将影响关节的结构和功能，有可能继续发展成为骨关节炎。 该研究用一种计算机模拟的分析方法（有限元分析），模拟了不同类型半月板撕裂情况下，膝关节应力的改变（橘红色越深，应力越大）。红色箭头指示处为半月板撕裂处2。（图片来源于参考文献2） 为了避免撕裂的半月板进一步磨损关节软骨，对于红区的损伤，应尽量外科干预进行缝合，对于白区的难以愈合的撕裂，通常只能把破损的半月板做部分切除。失去了“减震垫”的关节软骨受到的压力显著增高，因而继发产生软骨损伤和骨关节炎的概率也大大升高。 因此，针对如何修复半月板、让半月板愈合这一重要问题，科学家们做了大量的研究。干细胞作为再生医学和细胞治疗的重要发展方向，具有治疗多种疾病的潜力。比如，干细胞作为种子细胞可以参与受损组织的修复再生；干细胞可以分泌很多细胞因子和生长因子，改善损伤组织的微环境；干细胞还具有免疫调节能力，能控制炎症反应，促进损伤组织的修复等。我们在此挑选一些有代表性的基于干细胞技术的半月板再生策略进行简介，以飨读者。 半月板损伤的修复和再生策略 总体来说，对半月板撕裂的修复策略可分为两种：其一是直接将具有分化潜能的各类干细胞置于撕裂处，促进撕裂愈合；其二是通过递送特殊“信号”，把组织内部静息的干细胞动员并招募到受损区域，促进撕裂的愈合。对于切除的半月板促进其组织再生的方法则主要遵从了组织工程的技术原理，如利用具有生物活性的、允许组织长入的支架材料来填补缺损组织，或者，将干细胞和生物材料支架结合，令其在受损区重新长出一块完整的组织。 以上所述方法都已经在动物实验中取得了令人鼓舞的效果。 1.临床前研究（动物研究） 1.1 撕裂的半月板如何修复 在早期研究中，科学家们发现滑膜来源的干细胞可以修复白区半月板的缺损。比如向关节腔内注射同种异体的滑膜来源的干细胞，12周之后发现可以有效修复兔子半月板白区的撕裂（用了两百万个细胞）3，此方法也能修复猪的半月板前角撕裂（修复此类大动物用了两千万个细胞）4。但是，在研究的过程中科学家们逐渐发现这类直接注射异体干细胞的策略存在感染和免疫原性的风险，也就是说，可能发生排异反应。 为了避免这些问题，科学家们又设计出了另一种不采用异体细胞的修复策略，直接利用生物活性分子召集组织内的干细胞到缺损区，行使组织修复的功能。比如在撕裂的半月板内加入能够促进细胞迁移的结缔组织生长因子（CTGF），将附近组织的干细胞招募到缺损区，再利用另一种促进干细胞向软骨组织分化的转化生长因子β3 (TGFβ3)，令迁移来的干细胞变成软骨细胞并且产生半月板的细胞外基质。这项策略的治疗效果在兔子撕裂的半月板中得到了验证：招募而来的干细胞新生成了胶原纤维，并且能和撕裂的组织边界重新连接进行修复5。 通过干细胞募集诱导内部半月板撕裂无缝愈合（图源：参考文献5） 除了上述细胞生长因子，具有生物活性的一些金属离子也有类似的功能。比如，我国的科学家最近就发现了特定浓度的镁离子（5 毫摩尔）能促进滑膜干细胞的迁移和黏附。因为金属镁在体内降解的过程中会缓慢释放出镁离子，于是科学家们按照离子释放的曲线设计了一种高纯度的镁线 (99.98%)，能在受伤的关节中持续提供有效浓度的镁离子，然后用这些镁线缝合了10只兔子半月板的放射状撕裂，12周之后这些裂隙竟完全的愈合了6。 1.2 切除的半月板如何再生 对于切除的半月板，科学家采用了组织工程的方法和技术进行组织的重建和再生。 比如最近我国科学家就发明了一种先进的细胞召集策略，成功地为兔子重建了半月板。科学家们首先设计并运用三维打印技术制造了兼具力学支持性能和生物活性的支架材料（结合了聚己内酯PCL材料、脱细胞基质以及光固化水凝胶GelMA 和HAMA），并在其中加入了具有促进细胞迁移和血管生成作用的血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB），和可促软骨分化的小分子药物Kartogenin（KGN）的高分子材料缓释系统（用聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA进行缓释）7。这一设计兼顾了组织修复再生过程中的方方面面，例如，可降解的聚己内酯材料能在重建初期代替切除的半月板对关节进行力学支撑，三维打印加入的生物活性支架能够为细胞长入提供良好的微环境，生长因子PDGF-BB的加入能够迅速召集附近的干细胞迁移到支架材料当中，而缓慢释放的KGN分子保证了长入的细胞不断生成新的软骨组织，形成了一个复杂且完整的半月板再生策略。这些重新长出的半月板在六个月后大约能达到正常半月板一半的承重能力7。 用于半月板再生的无细胞双释药仿生支架示意图（图源：参考文献7） 另一组我国的科学家采用了干细胞、生长因子、生物材料以及在体外模拟体内半月板受力的可控动态应力加压装置，为兔子重建了完整的半月板，并且这些再生的半月板达到了接近正常半月板的异质性结构和力学强度。该研究通过三维打印制备出聚己内酯材料的半月板支架，并将骨髓间充质干细胞与其混合，得到具有干细胞的半月板生物支架，然后将其在置入动物体内前进行了四周的预处理，包括给予促进干细胞向纤维软骨和透明软骨分化的生长因子，并且加入了和正常半月板受力类似的力学刺激。这样通过干细胞、生物支架材料、力学和生物学刺激的协同作用得到了半成熟的组织工程化半月板，再植入兔子半月板切除模型当中，24周后得到了和正常半月板几乎无异的结构和功能8。 这些最新的研究结果代表了本领域最先进的研究策略和技术进展，但还处于动物研究阶段，尚未进入临床试验阶段。  2.干细胞在半月板修复和再生中的临床应用研究现状 有关干细胞技术的临床研究结果表明，一些干细胞对于骨骼肌肉系统的某些疾病和症状有治疗效果，例如组织工程软骨干细胞治疗能修复再生损伤的关节软骨（上期回顾：干细胞能治疗骨关节炎吗？），以及脂肪来源的干细胞能缓解骨关节炎的症状等。对于治疗撕裂的半月板，干细胞治疗的临床实验也正在进行中，这些研究还处在早期验证阶段（仅有I/II期临床试验和若干个案报告）。值得一提的是，在2014年的一项多中心I/II期临床试验中，关节腔内注射同种异体骨髓间充质干细胞显示出了良好的半月板重建效果，这项研究用了两种细胞剂量（50×106；150×106），临床症状均有改善9。 下表我们为大家总结了目前已有报道的66例干细胞及基于干细胞的组织工程治疗修复撕裂的半月板的临床研究结果。 表1 已报道的66例基于干细胞技术修复撕裂半月板的临床研究结果 发表年份 研究类型 （病例数） 细胞来源 细胞数量 使用方式 研究结果 参考文献 2014 I/II期临床试验（55例） 同种异体骨髓干细胞；50×106个细胞单次注射、150×106个细胞单次注射 细胞悬于玻璃酸钠，进行关节腔注射 该研究共招募了55名半月板部分切除患者，其中18名接受了50 ×106单剂量干细胞；另外18名接受了150×106的单次干细胞注射；19名患者接受玻璃酸钠（HA）注射。 随访结果显示，干细胞注射组在1年后半月板体积有了显著增长，显示出了良好的半月板重建潜力；患者的膝关节疼痛评分在注射2年后也有了显著改善。 9 2014 个案报告（1例） 自体脂肪干细胞；（未报道细胞量） 关节腔注射 该病例报告了1名左膝疼痛两年的32岁女性，伴膝关节肿胀2年，磁共振显示内侧半月板后角撕裂。注射自体脂肪干细胞3个月后，磁共振显示撕裂明显改善，18个月后，膝关节疼痛症状明显改善。 10 2019 个案报告（5例） 自体滑膜干细胞； 32–70 × 106个细胞 关节镜下干细胞悬液注射至半月板损伤原位 该病例报告了用自体来源的滑膜干细胞治疗5名退行性内侧半月板撕裂的患者。在关节镜下半月板缝合同时，收集少量滑膜组织，体外扩增2周后注射回撕裂的缝合处。2年随访显示，患者的疼痛显著改善，同时磁共振上撕裂部位明显恢复。 11 2017 个案报告（5例） 自体骨髓干细胞+胶原支架； 30,000个 细胞/平方毫米 关节镜下干细胞同支架移植至半月板损伤部位 该研究共招募5名半月板撕裂患者，进行自体骨髓来源的干细胞和胶原支架组成的组织工程技术进行治疗。随访2年后，其中3名患者已完全恢复，无任何临床症状，且无半月板撕裂的影像学征象。另外2名患者在术后15个月后因再次撕裂、不愈合进行了半月板的切除术。 12 结语 总体来说，利用干细胞移植修复半月板撕裂的研究已经到达了临床试验的阶段，从目前的短期随访结果来看，其干预效果是卓有成效的。但是想确认和推行这些治疗还需后期进行更大规模的、随访时间更长的临床试验和更多的基础研究。 对于重建切除的半月板，其再生策略还处在动物实验阶段，这也是近年来生物学与材料学结合进行临床转化研究的热点。   参考文献： Fox AJS, Wanivenhaus F, Burge AJ, et al. 2015. The human meniscus: A review of anatomy, function, injury, and advances in treatment. Clin. Anat. 28(2):269–287. Li L, Yang L, Zhang K, et al. 2020. Three-dimensional finite-element analysis of aggravating medial meniscus tears on knee osteoarthritis. J. Orthop. Transl. 20(March 2019):47–55. Horie M, Driscoll MD, Sampson HW, et al. 2012. Implantation of allogenic synovial stem cells. J. Bone J. Surg. A 94(8):701–712. Nakagawa Y, Muneta T, Kondo S, et al. 2015. Synovial mesenchymal stem cells promote healing after meniscal repair in microminipigs. Osteoarthr. Cartil. 23(6):1007–1017 Tarafder……